Multimediální pomůcka pro předmět Chemie potravních řetězců:

VYUŽITÍ METODY SPME PŘI ANALÝZE LÁTEK POCHÁZEJÍCÍCH Z POLYMERŮ KONTAMINUJÍCÍCH POTRAVNÍ ŘETĚZCE (SOP)

 

Ing. Michaela Charvátová, Ph.D.

 

Předmluva

Předkládaná multimediální pomůcka pro předmět Chemie potravních řetězců „Využití metody SPME při analýze látek pocházejících z polymerů kontaminujících potravní řetězce (SOP)“ seznámí studenty se základy moderní extrakční metody – Mikroextrakce na tuhou fázi (Solid Phase Microextraction, SPME). Výuka praktických cvičení byla právě o metodu SPME rozšířena. Výhodou této metody je nenáročná manipulace se vzorkem při sorpci i při desorpci a také patří nízká spotřeba organických rozpouštědel a nízká časová náročnost.


Součástí tohoto studijního materiálu jsou návody na praktická cvičení. Návody jsou doplněny fotografiemi, které zachycují práci při SPME extrakci.

Seznam použité literatury je uložen v dokumentaci Ústavu veterinární ekologie a ochrany životního prostředí FVHE VFU Brno.

Za odborné posouzení a věcné připomínky děkujeme recenzentům a dalším odborníkům.

Multimediální pomůcka je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.


Mikroextrakce tuhou fází 

1. PRINCIP metody

Metoda Mikroextrakce na tuhou fázi (SPME – Solid Phase Microextraction) byla vyvinuta J. Pawliszynem v roce 1989. Je jednoduchá a účinná adsorpčně-desorpční technika zkoncentrování analytu, při které nejsou zapotřebí rozpouštědla nebo komplikované skleněné aparatury. Metoda SPME je použitelná ve spojení s plynovou, ale i kapalinovou chromatografií, pro stanovení těkavých i netěkavých látek.

Hlavní součástí celého zařízení je 1 cm dlouhé křemenné vlákno, které je pokryté stacionární fází. Vlákno je spojeno s ocelovým pístem umístěným v duté ocelové jehle, která ho chrání před mechanickým poškozením. Před začátkem manipulace a po ukončení extrakce je vlákno zataženo dovnitř jehly; posunutím pístu se vlákno vysune do vzorku a dochází k sorpci.

 

Obrázek I:  Zařízení pro vzorkování pomocí SPME

2. OPTIMALIZACE metody

Získání dobrých a spolehlivých výsledků při používání metody SPME je ovlivněno celou řadou faktorů, např. polaritou a tloušťkou stacionární fáze, způsobem vzorkování, hodnotou pH, iontovou silou roztoku, teplotou vzorku, mícháním apod.

2.1 Vliv stacionární fáze

Výběr stacionární fáze, která kryje vlákno, ovlivňuje povaha sledované látky.  Vlákna  s nepolární fází by se měla používat pro extrakci nepolárních analytů a naopak. I malé rozdíly v polaritě stacionární fáze nemusí vést ke srovnatelné sorpční selektivitě. Účinné jsou přídavky sorbentů do polymeru (např. silně polární divinylbenzen/Carboxen/polydimethylsiloxan), což má za následek zvětšení specifického povrchu a zvýšení extrakce malých polárních molekul.
Citlivost SPME metody ovlivňuje také tloušťka stacionární fáze vlákna. Silnější vrstva je schopna vyextrahovat více analytu než vrstva tenká. Proto se vlákno se silnější vrstvou používá pro zachycení těkavějších látek. Tenká vrstva naopak zajišťuje zrychlenou difůzi a uvolnění výše vroucích látek během tepelné desorpce. Silná vrstva sice účinněji extrahuje výše vroucí složky ze vzorku, avšak desorpce je dlouhotrvající proces a analyt může být přenášen do další extrakce. 

2.2 Vliv délky doby sorpce 

Doba sorpce se většinou volí tak, aby bylo dosaženo co možná největší extrakce analytu (dosažení rovnováhy – nejvyšší citlivost, dobrá opakovatelnost). Optimální doba se  nejčastěji zjistí proměřením závislosti výtěžnosti analytu na době sorpce. V některých případech se však ustanovení rovnováhy nedosáhne ani po několika hodinách, a proto lze volit kratší extrakční dobu, kterou je vhodné dodržovat při všech analýzách pro zajištění dobré opakovatelnosti.

 

2.3 Vliv zahřívání vzorku 

Záhřev vzorku obecně zkracuje čas potřebný k dosažení rovnováhy; v důsledku toho se zkracuje i doba sorpce. U některých vzorků je zahřívání nutné, např. při headspace analýze složitých matric a analýze méně těkavých sloučenin. V headspace prostoru se potom zvýší koncentrace analytů, což umožňuje rychlejší a účinnější extrakci.



2.4 Způsob vzorkování 

Metoda SPME umožňuje provádět dva způsoby extrakce. První způsob je přímá SPME, označovaná zkratkou DI-SPME (Direct Immersing SPME), při které dochází přímo k ponoření vlákna do vzorku. Druhým způsobem je headspace SPME, označovaná zkratkou HS-SPME (Headspace SPME). Tato druhá varianta využívá extrakci analytů z prostoru nad vzorkem v uzavřené nádobě. Na obrázku II jsou znázorněny oba tyto způsoby vzorkování.
DI-SPME se používá především pro látky v kapalném skupenství. V potravinářství mohou matrice obsahovat makromolekulární látky, jako jsou například proteiny, které mohou ovlivňovat průběh SPME. K jejich odstranění je zapotřebí filtrace, odstředění apod. HS-SPME se používá pro extrakci těkavých látek. Ustálení rovnováhy mezi vláknem a analytem v plynném stavu je rychlejší než u DI-SPME, protože molekuly analytu se rychleji pohybují v plynu než v ostatních skupenstvích, nicméně je ještě potřeba vyčkat ustavení rovnováhy mezi kapalnou a plynnou fází. Čas, který je potřeba pro vzorkování HS-SPME je většinou relativně krátký, 5-15 min.

 

Obrázek II: Schéma přímé SPME a headspace SPME; adsorbce a desorbce

 

2.5 Vliv míchání vzorku 

Míchání vzorku zlepšuje a zkracuje extrakci, zejména u molekul s vyšší molekulovou hmotností. Proměnlivé míchání je nežádoucí, protože způsobuje nižší opakovatelnost stanovení.
Ultrazvuk zvyšuje adsorpci analytu, ale zároveň vede k zahřívání vzorku. Může tak podpořit přechod analytu do prostoru headspace a zlepšit tento způsob extrakce.

 

2.6 Vliv objemu vzorku 

Objem vzorku bývá volen na základě rozdělovacího koeficientu vlákno-vzorek Kfs. Hodnoty koeficientu jsou pro různé analyty tabelovány, mohou se také vypočítat nebo určit experimentálně (dosažení rovnováhy). Musí se rovněž zohlednit ztráty analytů během doby potřebné k ustanovení rovnováhy (adsorpce na stěny, mikrobiální degradace).
V praxi se doporučuje zachovávat objem vzorku mezi 1 až 5 ml a používat stejný objem pro vzorky a kalibrační standard.



3. VYUŽITÍ SPME

SPME metoda má řadu aplikačních využití. Používá se zejména v oblasti znečištění životního prostředí (PCB, PAH, pesticidy, fenoly, organokovové sloučeniny – Hg, Sn, Pb), ve farmaceutickém průmyslu, dále v léčebné kosmetice, v potravinářství (vonné a chuťové látky, mastné kyseliny, nežádoucí exogenní i endogenní kontaminanty) a rovněž ve forenzní analýze, toxikologii a jiných oborech.

Výrobce SPME vlákna uvádí použitelnost až pro sto analýz v závislosti na použité technice SPME (přímá x headspace) a v případě přímé SPME na povaze vzorku.

Tabulka I: Aplikace SPME

 

Matrice

 

Analyt

Podmínky extrakce

Vlákno

SPME metoda

Doba

(min)

Teplota

(°C)

Míchání /vysolení

 

 

 

Víno

procymidon, herbicidy

PDMS

přímá

30

lab.

+ / n

OCHI, herbicidy, fungicidy

PDMS

přímá

30

 

lab.

+ / + MgSO4

těkavé látky –aroma

PA

přímá

30

lab.

+ / n

Jehličí

monoterpeny

PDMS

head-space

5

40

n / n

 

Obilí

organofosfáty

PDMS

přímá

90

lab.

n / n

těkavé látky –aroma

PDMS

head-space

30

30

n / n

 

Voda

PCB, PAH

PDMS

přímá

10

lab.

+ / n

organofosfáty

PA

přímá

30

lab.

+ / n

organofosfáty

PDMS

přímá

30

lab.

+ / n

 

Půda

PCB

PDMS

přímá

15

lab.

n / n

organofosfáty

PA

head-space

60

80

n / n

fungicidy

PA

přímá

45

lab.

+ / + NaCl

karbamáty

CW-TPR

přímá

60

lab.

n / n





4. PoSTUP

Pro stanovení polymerních látek (bisfenol A a bisfenol F) bude jako testovaný vzorek použita voda (pitná balená v PET lahvích, z vodovodního řádu a povrchová). 

SPME extrakce

  1.  Do 10 ml lahvičky přidáme 7,5 ml vzorku sledované vody a 100 µl acetonitrilu (obr.SPME1). Přidáme železné míchadlo a lahvičku uzavřeme pomocí krimplovacích kleští (obr.SPME2).
  2.  Lahvičku se vzorkem 10 minut inkubujeme za stálého míchání při laboratorní teplotě (obr.SPME3).
  3.  Pomocí špendlíku propíchneme septum (obr.SPME4), což nám ulehčí manipulaci při vsouvání jehly do vzorku. Vsuneme jehlu do lahvičky (obr.SPME5) a vysuneme SPME vlákno do vzorku vody (přímá SPME; obr.SPME6).
  4. Extrakce látek na vlákno probíhá 10 minut za stálého míchání vzorku (obr.SPME7).
  5. Po uplynutí extrakční doby SPME vlákno zasuneme do jehly a vytáhneme z lahvičky.

 

Rozdělení a vyhodnocení látek pomocí GC/MSD

  1. Přejdeme k plynovému chromatografu, jehlu SPME držáku vsuneme do nástřikového prostoru a vysuneme vlákno - provede vyučující (obr.SPME8). Ihned spustíme analýzu (obr.SPME9).
  2.  Po skončení analýzy bude studentům na záznamu jejich vzorku předvedeno, jak se vzorky vyhodnocují (obr.SPME10).

 

V následující tabulce jsou uvedeny charakteristiky metody GC-MS – SPME

Tabulka II: Charakteristiky metody GC-MS – SPME

Analyt

RSD [%]

LOD [μg/l]

LOQ [μg/l]

Bisfenol A

8,1

1,358

4,527

Bisfenol F

5,4

3,393

11,310

 

 

Multimediální pomůcka je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.